HPLC (高效液相色譜法) 由于具有分析速度快、特異性強、準確度高、精密性好以及易于自動化等優(yōu)點，使其成為檢測、分離和定量領域最常用的分離技術。為了優(yōu)化 HPLC 方法，我們需要研究多個色譜參數(shù)，包括：樣品前處理、流動相選擇、色譜柱選擇和檢測器選擇。本文的目的是介紹方法開發(fā)、優(yōu)化和驗證流程。
建立分析方法的流程包括：色譜條件優(yōu)化和了解分析物的理化性質(zhì)。隨后的步驟包括樣品制備、方法改進和方法驗證，以確保分析結果的準確和可靠。
了解分析物的理化性質(zhì)
在為分析物制定分析方法時，了解其理化性質(zhì)至關重要。首先考慮的因素包括分析物的 pH 值、極性、溶解度和 pKa。極性是一個關鍵的物理性質(zhì)，它指導著溶劑和流動相組分的選擇。分析物的溶解度與極性相關，遵循“相似相溶”的原則。流動相或稀釋劑的選擇則受分析物溶解度的影響，以確保兼容性。分析物不能與 HPLC 系統(tǒng)成分發(fā)生反應，且能溶解。Ph 和 pKa 等參數(shù)在 HPLC 方法開發(fā)中至關重要，影響著溶劑的選擇和整個方法的成功與否。
在 HPLC中，針對可電離的分析物，優(yōu)化 pH 值往往能獲得尖銳、對稱的色譜峰。在定量分析中，要獲得低檢測限、低進樣偏差和穩(wěn)定保留時間，確保精確測量和可靠結果所需的精度和靈敏度，尖銳且對稱的色譜峰至關重要。
優(yōu)化色譜條件
在方法開發(fā)初始階段，需要確定一套條件，包括檢測器、色譜柱和流動相，并生成樣品的“初始”色譜圖。通常使用帶有紫外檢測功能的 C18 色譜柱進行反相分離。在這一階段，需要決定是：開發(fā)梯度方法還是等度方法，這兩種方法都具有不同的優(yōu)勢，具體取決于分離要求和分析物的性質(zhì)。
選擇色譜柱
色譜柱是色譜儀的核心，在實現(xiàn)可靠、準確的分析中起著舉足輕重的作用。選擇好的色譜柱可確保良好的色譜分離效果，從而獲得值得信賴的結果。反之，色譜柱選擇不當會導致分離不充分和混亂，使結果無效或難以解釋。
在方法開發(fā)過程中，改變色譜柱會極大地影響待測物的分離度。粒度、保留能力、固定相化學成分和色譜柱尺寸等因素對于選擇適合特定分析應用的理想色譜柱至關重要。色譜柱的三個基本組成部分是：硬件、填料和固定相。氧化鋁、鋯、聚合物以及最常見的硅膠等填料作為固定相的載體。硅膠因其強度高、球形大小一致、易于衍生和耐壓而受到青睞。在選擇理想的色譜柱時，需要考慮的因素包括顆粒大小、保留能力、固定相化學成分和色譜柱尺寸。這些因素共同影響著色譜柱在特定分析應用中實現(xiàn)準確可靠分離的效率和效果。
硅膠在大多數(shù)有機溶劑和低 pH 值環(huán)境中化學性質(zhì)穩(wěn)定。然而，其缺點是傳統(tǒng)的硅膠在 pH 值超過 7 時會分解。所以說色譜柱選擇時也需要主要PH適用范圍（注：色譜柱說明書上有ph適用范圍），否則選擇不合適的色譜柱進行使用會導致色譜柱壽命大打折扣。硅膠的成分、形狀和粒度均會對分離產(chǎn)生影響。一般來說，粒度越大，理論塔板數(shù)越多。正相或反相色譜柱的適用性取決于所采用的固定相類型，這凸顯了硅膠色譜柱在各種色譜應用中的多功能性。
正相色譜涉及使用極性固定相和非極性流動相，極性分子的洗脫時間通常晚于非極性分子。在反相色譜中，色譜柱的選擇至關重要。例如，丙基色譜柱（C3）、丁基色譜柱（C4）和戊基色譜柱（C5）對具有疏水殘基的大分子和肽類物質(zhì)非常有利，尤其是在離子對色譜法（C4）中。不過，與 C8 或 C18 固定相相比，C3-C5 色譜柱保留非極性分析物的效果通常較差。這些色譜柱化學成分的變化使得在色譜分析中可以對不同化合物進行定制化分離。
YMC-Pack C4、Luna C5 和 Zorbax SBC3 等反相色譜柱代表了反相色譜柱的特點。不過，與烷基鏈較長的色譜柱相比，烷基鏈較短的色譜柱（如 C4 和 C5）可能具有較低的抗水解性。辛基（C8）相在各種應用中都很有用，對類固醇、核苷和藥物等化合物具有優(yōu)勢，但其保留性不如 C18 相。固定相或色譜柱的選擇在方法開發(fā)中至關重要，因為如果沒有可靠、高性能的色譜柱，就很難建立可重現(xiàn)的程序。穩(wěn)定性和可重現(xiàn)性對于避免在方法開發(fā)過程中出現(xiàn)樣品保留問題至關重要。影響這種差異的關鍵因素包括鍵合固定相的參數(shù)、硅膠填料的特性以及色譜柱的直徑。硅膠填料因其有利的物理特性而成為現(xiàn)代色譜柱的首選，在實現(xiàn)分析應用的多樣化和精確分離方面具有多功能性和高效性。
色譜柱選擇時也需要主要PH適用范圍（注：色譜柱說明書上有ph適用范圍），否則選擇不合適的色譜柱進行使用會導致色譜柱壽命大打折扣。
分離模式選擇
分離模式由分析物的極性和分子量決定。在實際應用中，反相色譜法（RPC）尤其適用于小型有機化合物。反相色譜廣泛用于分離酸堿等可電離物質(zhì)，采用離子對試劑或含緩沖鹽流動相來防止分析物發(fā)生電離。
等度/梯度模式選擇
探索梯度是指：在設定的時間內(nèi)（標準為 20 分鐘），從約 5-10的 %B（B;一般為有機相） 到 100 %B 的線性梯度。洗脫強度在 100% B 時保持幾分鐘，以確保所有樣品組分都已洗脫。對于反相梯度洗脫，通常選擇水（或緩沖液，如果有可電離的分析物）和乙腈作為流動相。使用易揮發(fā)的緩沖液（如甲酸銨）可使方法與用于 LC-MS 的質(zhì)譜兼容。從色譜圖中可以看出很多有關流動相組成、色譜柱化學成分和分離所需的分析模式的信息。如果化合物在梯度結束后的洗脫時間超過梯度時間的 25%，則需要使用更強的 B 溶劑或保留性更差的色譜柱進行分析。此外，公式 1（其中 tG 為檢測梯度時間，△t為第一個峰至最后一個峰所需要的時間），△t/ tG ＜0.25一般選擇等度分析，反之選擇梯度模式更為合適，可用于確定是否可以進行等度分離；這始終是首選，因為它可提高樣品的分析通量（無需重新平衡時間）并簡化分析。在建立梯度時，應將洗脫出第一個峰的流動相成分作為初始流動相成分或者也可做為稀釋劑。
流動相的選擇以及優(yōu)化
盡量選擇毒性小的溶劑，我們應該了解常用試劑的MSDS，尤其了解其毒性以及如何處理突發(fā)情況。
2.然后我們選的溶劑之間是相互互溶的。
3.與檢測器匹配：紫外：流動相的截止波長要低于樣品的檢測波長；RI：流動相的折光系數(shù)與樣品的差異較大；ELSD：揮發(fā)性或受熱分解成氣體的流動相；質(zhì)譜：能促進相應離子源模式下化合物的電離。
4.粘度低：高粘度溶劑會影響傳質(zhì)和擴散，降低柱效，柱壓會高。
5.流動相pH：反相模式下，對于可電離的化合物，應調(diào)節(jié)流動相pH使待測物不電離，處于分子狀態(tài)。一般酸性分析物使用流動相pH比分析物酸度系數(shù)更低的流動相，堿性分析物使用流動相pH比分析物酸度系數(shù)更高的流動相。
6.流動相中的緩沖鹽：應考慮緩沖鹽在有機相中的溶解度，一般運行梯度不會超過70%有機相，防止泵頭處鹽析，應考慮將B相配制成有機相與水混合溶液。
7.離子對試劑能不用盡量不用，如果用的話，盡量專柱專用，因為離子對會使色譜柱填料改性。
8.流動相的純度，HPLC用色譜純有機相，水用二次純水或屈臣氏蒸餾水，質(zhì)譜需用質(zhì)譜純的有機相和水。
9.不能對色譜系統(tǒng)造成損壞，比如二氯甲烷會腐蝕泵的金屬組件，可與其他試劑預混后使用，用完要及時置換系統(tǒng)；堿性流動相會對普通色譜柱的硅膠溶解塌陷，有機雜化的硅膠對堿性環(huán)境的穩(wěn)定性更好一些。
10.不對樣品造成破壞。
另外對于制備色譜的流動性有兩點補充：
1.對樣品有一定的溶解性，如果對樣品的溶解性差，會導致樣品析出，會影響分離，甚至堵塞進樣器或色譜柱。
2.揮發(fā)性好、沸點低，利于分離后的餾分后處理。
? pH 值的影響
對于可電離的分析物，根據(jù)分析物的 pKa 值確定合適的流動相 pH 值至關重要。這可確保目標分析物處于中性或離子化狀態(tài)。調(diào)節(jié)流動相 pH 值是優(yōu)化分離的重要方法。pH 值調(diào)節(jié)在調(diào)整色譜條件以實現(xiàn)理想的分離效果方面起著至關重要的作用。
? 有機相的影響
為反相 HPLC 選擇有機相通常很簡單，最常用的是乙腈和甲醇（偶爾也用 四氫呋喃）。在溶劑強度保持不變的等度條件下，要使復雜的多組分樣品中的每種成分都得到最佳的洗脫效果，可能具有挑戰(zhàn)性。因此，通常采用梯度洗脫，允許在 k（保留因子）1 到 10 之間改變有機相成分。這種動態(tài)方法可提高分離效率，尤其適用于 HPLC 中的復雜混合物。
檢測器和波長的選擇
色譜分離后，使用適當?shù)臋z測器對目標分析物進行鑒定。液相色譜（LC）中常見的檢測器包括：紫外檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器、示差檢測器和質(zhì)譜檢測器。
檢測器的選擇受樣品性質(zhì)和分析目標的影響。例如，在多組分分析中，吸收光譜可能會比母體化學物質(zhì)的吸收光譜波長更長或更短，這就影響了選擇合適的檢測器來進行準確和有選擇性的鑒定。
在 LC 分析中，檢測器的選擇對達到所需的靈敏度和特異性起著至關重要的作用。在紫外檢測中，目標分析物和雜質(zhì)的光譜必須在不同波長下采集、疊加，然后進行歸一化處理。選擇波長對于確保大多數(shù)分析物都有足夠的響應，從而在液相色譜中進行準確可靠的檢測至關重要。仔細考慮不同波長的紫外光譜可確保分析方法對樣品中的所有相關成分都很敏感，從而提高分析的精確度和可靠性。
創(chuàng)建分析方法
反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分析方法開發(fā)的初始階段包括選擇各種色譜參數(shù)，如流動相、色譜柱、流動相流速和流動相 pH 值。通過試驗，對每個參數(shù)進行優(yōu)化，然后與系統(tǒng)適用性參數(shù)進行比較。典型的參數(shù)包括：保留時間超過 5 分鐘、理論板數(shù)超過 2000 板、拖尾因子小于 2、分辨率大于 5 以及標準色譜中分析峰面積的相對標準偏差 (R.S.D.) 不超過 2%。這些參數(shù)確保了 RP-HPLC 方法的可靠性和精確性。
樣品制備
樣品制備是高效液相色譜（HPLC）分析的關鍵步驟，可確保獲得均勻且可重復的溶液注入色譜柱。樣品制備的目的是：制備出與色譜柱兼容且與所需 HPLC 方法相匹配的無干擾等分樣品。這就需要選擇能溶解在流動相中而不影響保留或分辨率的樣品溶劑。樣品制備的初始步驟包括：收集樣品并將其注入色譜柱，為準確可靠的色譜分析奠定基礎。識別方法中的弱點，并采用實驗設計來增強它。評估該方法對各種樣品、設備配置和環(huán)境因素的影響。這一迭代過程有助于完善方法，確保 HPLC 分析在不同條件下的穩(wěn)定性、可靠性和適用性。
供試品溶液的濃度：分析方法的定量限應當≤報告限度。
稀釋劑：對于檢測方法無干擾，溶解性好、溶液穩(wěn)定、無溶劑效應、經(jīng)濟環(huán)保。
提取方式：超聲（功率，頻率，水溫），震搖-耐用性、溶液穩(wěn)定性。
稀釋劑體積：小規(guī)格制劑關注輔料所占比例。
溶液的處理：濾過（引入雜質(zhì)，濾膜吸附），離心。
輔料：積分時空白輔料應當予以扣除，根據(jù)耐用性驗證中空白輔料出峰時間擬定范圍，必要時標準中應當增訂空白輔料溶液進樣，輔料與API的反應。
驗證
驗證是評估和提供客觀證據(jù)的系統(tǒng)過程，證明滿足特定預期用途的具體要求。它包括評估方法的性能并證明其滿足特定標準的能力。基本上，驗證可以讓您徹底了解您的技術可以可靠地產(chǎn)生什么結果，尤其是在處理痕量或 HPLC 等分析方法中存在挑戰(zhàn)性條件時。
初步驗證應當進行：強制講解（分離度、物料平衡、峰純度）、耐用性、定量限、溶液穩(wěn)定性（雜質(zhì)儲備液、供試品溶液；對照品溶液）、準確度。
方法驗證
驗證是實驗室測試的過程，以證明分析方法的性能特征符合預期分析應用的要求。無論是由多個操作人員在相同或不同的實驗室中使用相同的設備，任何新的或更新的方法都必須經(jīng)過驗證，以確保其始終產(chǎn)生可重復且可靠的結果。特定的方法及其預期用途決定了所需驗證程序的類型，從而確保分析過程穩(wěn)健并適合各種環(huán)境下的目的。
方法驗證結果是任何可靠分析程序的重要方面，提供對分析結果質(zhì)量、一致性和可靠性的評估。驗證過程的關鍵是使用符合規(guī)格、經(jīng)過正確校準、運行正常且功能正常的設備。驗證過程確保對分析方法進行徹底評估，如果不符合要求的標準，則驗證方法可以使用或失效。這確保了各種應用中分析結果的準確性和可靠性。
以下是FDA、USP和ICH推薦的典型參數(shù)：
1.專屬性
2.線性與范圍
3.精密度，包括方法精密度（重復性）和批內(nèi)批間精密度（重現(xiàn)性）
4.準確度（回收率）
5.溶液穩(wěn)定性
6.檢測限
7.定量限
8.可報告區(qū)間
9.系統(tǒng)適應性
